مولكول های پرانرژی چگونه برای تولید تركیبات قندی یا كربوهیدرات ها مورد استفادة ‌گیاه قرار می گیرند

واكنش های تاریكی

در این بخش به این موضوع می پردازیم كه .

الف- چرخة كلوین: در سالهای بین 1946 تا 1953 سه تن از دانشمندان به نامهای ملوین كلوین، جیمز بشام و آندروبنسون راه متابولیكی تبدیل گازكربنیك به قند را در گیاهان كشف كردند. آنها این كار را از طریق پیگیری از بین رفتن گازكربنیك رادیواكتیو نشان دار در كشت های سلول های جلبك انجام داده اند. آزمایشهای اولیة كلوین نشان داد جلبك هایی كه به مدتی كه دقیقه و یا بیشتر در معرض گازكربنیك نشان دار قرار گرفته بودند، تركیب پیچیده ای از متابولیت های نشان دار، شامل قندها و اسیدهای آمینه تولید كردند. با وجود این ، تجزیة جلبكی كه 5 ثانیه در معرض گازكربنیك نشان دار قرار گفته بود نشان داد كه اولین تركیب پایدار رادیواكتیو فعال كه در جلبك تشكیل گردید 3- فسفوگلیسرات یا PG3 بوده است كه در ابتدا فقط از طرف گروه كربوكسیل (-COOH) نشان دار شده است. این نتایج بلافاصله این پیشنهاد را مطرح می سازد كه PG3 توسط كربوكسیلاسیون یك تركیب دوكربنه به دست آمده است. چنین مادة‌ پیش ساختی تاكنون كشف نشده است. چنانچه واكنش كربوكسیلاسیونی واقعاً اتفاق بیفتد فقط روی یك قند 5 كربنه به نام ریبولوز –5- فسفات یا RU5P انجام می گیرد.

در نتیجة كربوكسیلاسیون قتند 5 كربنة ریبولوز –5- فسفات، یك قند 6 كربنه به دست می آید كه به دو تركیب سه كربنه تجزیه می گردد و هر كدام  از این تركیبات سه كربنه به یك ملكول PG3 تبدیل می گردند. راه كلی این تغییر و تبدیل را كه در شكل شمارة 219 نشان داده شده است، چرخة كلوین و یا جرخة احسایی پنتوز فسفات می نامند. این راه شامل كربوكسیلاسیونیك پنتوز، تشكیل تركیبات قندی و بازیافت ریبولوز –5- فسفات یا Ru5P می باشد.

در جریان جستجوی یافتن كربوكسیلاسیون مادة مور اثر، تركیبات حد واسط نشان دار فراوان دیگری كشف گردیدند. به عنوان مثال در مراحل اولیة راه،‌‏ فقط كربن های شماره 3 و 4 در قند 6 كربنة فروكتوز –1، 6- بیس فسفات یا FBP نشان دار هستند، ولی در مراحل بعدی تعداد كمتری از كربن های این قند نشان دار شده و شمارة ‌این كربن ها كمتر از تركیبات قند در مراحل اولیة ‌راه است . مشاهدة جریان حركت كربن نشان دار در انواع مختلف قندهای سه، پنج، شش و هفت كربنه ساختمان اصلی راه متابولیكی پیشندی كلوین را  مشخص می كند كه به طور كامل در شكل شمارة 219 آمده است. واقعیت بسیاری از واكنش هایی كه قبلاً به صورت پیش بینی بیان شده بود در مطالعات بعدی آزمایشگاهی با استفاده از آنزیم های مختلف به تأیید رسیده است.

1-چرخة‌ كلوین در یك فرایند دو مرحله ای از گاز كربنیك GAP تولید می كند- چرخة كلوین را می توان به دو مرحله تقسیم كرد:

مرحلة اول- مرحلة‌ تولید (قسمت بالایی شكل شمارة‌219) كه در آن سه مولكول ریبولوز –5- فسفات یا Ru5p با سه مولكول گازكربنیك برای تولید 6 مولكول گلیسرآلدئید –3- فسفات یا GAP وارد واكنش می شوند. در این واكنش های بیوشیمیایی 9 مولكول ATP و 6 مولكول NADPH مورد استفاده قرار می گیرد. طبیعت چرخه ای این راه متابولیكی باعث می شود كه این فرایند بتواند به ازای هر سه مولكول گازكربنیك مصرفی، معادل یك ملكول گلیسرآلدئید –3- فسفات یا GAP تولید نماید. در این نقطه از راه متابولیكی یك مولكول GAP می تواند از چرخه خارج شده و در راههای دیگر متابولیكی مورد استفاده سلول قرار گیرد.

مرحلة دوم: مرحلة بازیافت ( قسمت پایینی شكل شمارة 219) كه در آن اتم های كربن 5 مولكول گلیسرآلدئید –3- فسفات یا GAP باقیمانده ، شبه راه پنتوز فسفات، دریك سری از واكنش های بیوشیمیایی شركت می كند تا اینكه در نهایت برای شروع مجدد چرخة، سه مولكول ریبولوز –5- فسفات تولید نمایند. این مرحله را می توان به چهار سری واكنش به صورت زیر تقسیم كرد. شماره واكنش ها با شمارة آنها در شكل شمارة‌219 مطابقت دارد:

به طور كلی می توان چرخة‌ كلوین را در معادلة سادة ذیل خلاصه كرد:

باید به این نكته توجه كرد كه مرحلة‌دوم چرخة كلوین بدون استفاده از مولكول های پرانرژی ATP و NADPH انجام می گیرد.

اولین واكنش چرخة كلوین فسفوریلاسیون ریبولوز –5- فسفات یا RU5P به كمك آنزیم فسفوریبولوكیناز است كه در این واكنش ریبولوز-5‌، 5- بیس فسفات یا RuBP تولید می گردد. بعد از كربوكسیلاسیون، مولكول RuBP مولكول 3- فسفوگلیسرات به دست آمده ابتدا به مولكول 1،3- بیس فسفوگلیسرات یا BPG تبدیل شده و سپس به GAP تبدیل می شود.

مرحلة دوم چرخة‌ كلوین با واكنش ایزومریزاسیون مولكول گلیسرآلدئید –3- فسفات به دی هیدروكسی استون فسفات یا DHAP توسط آنزیم تریوز فسفات ایزومراز آغاز می شود كه این واكنش برعكس واكنش معروف شمارة 5،‌ راه گلیكولیز است. بعد از این واكنش،‌ دی هیدروكسی استون فسفات می تواند در مسیر دو راه یكسان وارد واكنش های بیوشیمیایی بعدی شود: واكنش ها شمارة ‌6 تا 8 و یا واكنش های شمارة 9 تا 11، واكنش های شمارة 6 و 9 از چرخة كلوین، واكنش های تراكم عامل آلدئیدی با دی هیدروكسی استون فسفات است كه این واكنش ها به كمك آنزیم آلدولاز كاتالیز می شوند . نتیجة ‌آن اتصال دی هیدروكسی استون فسفات به یك آلدئید است. واكنش شمارة 6 همچنین برعكس واكنش شمارة 4، راه گلیكولیز است. واكنش های شمارة‌ 7 و 10 واكنش های هیدرولیز فسفات هستند كه از هر كدام از این واكنش ها، یك مولكول فسفات معدنی Pi تولید می شود و این واكنش به ترتیب توسط آنزیم هایی به نامهای فروكتوز بیس فسفات از یا FBPase و سدوهپتولوز بیس فسفات از یا sbpASE كاتالیز می شوند. باقیماندة واكنش های چرخة كلوین توسط آنزیم هایی كاتالیز می شوند كه در آن پنتوز فسفات نیز همین واكنش ها ار كاتالیز می نمایند. در واكنش های شمارة 8 و 11 كه هر دو توسط آنزیم ترانس ستولاز كاتالیز می شوند،‌ یك واحد دو كربنة ستونی از یك قتند ستوزی به مولكول گلیسرآلدئید –3- فسفات منتقل می گردد و در نتیجه یك قند 5 كربنة ستوزی به نام گزیلولوز –5- فسفات یا Xu5P تولید می شود. در نتیجة انجام این واكنش ها فرآورده های دیگری نیز تولید می شوند كه عبارتند از قند 4 كربنة آلدوزی به نام اریتروز –4- فسفات یا E4P كه از واكنش شمارة 8 و ریبوز –5- فسفات یا R5P كه از واكنش شمارة 11 به دست می آیند. قند اریتروز –4-فسفات یا E4P تولیدی در واكنش شمارة 8 به عنوان یكی از دو واكنش گر، وارد واكنش شماره 9 می شود. مولكول های گزیلولوز –5- فسفات یا Xu5P تولیدی در واكنش های شمارة 8 و 11 به كمك آنزیم فسفوپنتوزاپیمراز در واكنش شمارة 12 به ریبولوز –5- فسفات یا Ru5p تبدیل می شود. ریبوز –5- فسفات یا R5P به دست آمده از واكنش شمارة‌11 نیز به نوبة خود توسط آنزیم ریبوز فسفات ایزومراز در واكنش شمارة 13 به Ru5P تبدیل می شود و در نتیجه چرخة كلوین تكمیل می گیردد. از 11 آنزیمی كه در چرخه كلوین فعال هستند، تنها سه آنزیم در بافت های حیوانی وجود ندارند كه عبارتند از فسفوریبولوكیناز،‌ ریبولوز بیس فسفات كربوكسیلاز و سدوهپتولوز بیس فسفاتاز یا SBPase .

2- آنزیم ریبولوز بیس فسفات كربوكسیلاز واكنش تثبیت گاز كربنیك را كاتالیز می نماید:

یكی از مهمترین آنزیم های جهان كه واكنش تثبیت گازكربنیك را كاتالیز می نماید،‌ ریبولوز بیس فسفات كربوكسیلاز یا RuBP carboxylase است، زیرا تقریباً تمامی حیات روی كرة زمین بستگی به فعالیت آن دارد. این پروتئین احتمالاً به علت پایین بودن راندمان كاتالیزوری بستگی به فعالیت آن دارد. این پروتئین احتمالاً به علت پایین بودن راندمان كاتالیزوری (Kcat تقریباً برابر  )، حدود 50 درصد پروتئین های برگ را تشكیل می دهد،‌ بنابراین فراوان ترین نوع پروتئین در عالم حیات است . آنزیم ریبولوز بیش فسفات كربوكسیلاز در گیاهان عالی و اغلب موجودات ذره بینی فتوسنتزی از 8 زیر واحد بزرگ (L) (477 باقیماندة اسیدهای آمینة‌ در برگهای توتون) رمز گشایی شده توسط DNA كلروپلاست و 8 زیر واحد كوچك (S) (123 باقیماندة‌ اسید آمینه) رمزگشایی شده توسط ژن موجود در هسته، تشكیل شده است و این آنزیم را با  نشان می دهند. مطالعات اشعة X كه از این آنزیم توسط كارل-ایواربراندن و دیوید ایزنبرگ انجام گرفته است، نشان می دهد كه آنزیم  تقارن یك منشور مكعبی را دارد. زیر واحد بزرگ آنزیم از یك زنجیر پلی پپتیدی با ساختمان غالب بتا  و یك ساختمان فنری شكل  حاوی جایگاه فعال آنزیم،‌ تشكیل شده است (شكل شماره 220). وظیفة زیر واحد كوچك آنزیم  هنوز مشخص نشده است.

راهكار پذیرفته شدة‌ نحوة عمل آنزیم RuBP كربوكسیلاز كه در حد وسیعی توسط خود كلوین مشخص شده بود در شكل شمارة‌221 نشان داده شده است. در اولین واكنش آنزیم، یك پروتون از كربن شمارة‌3 ریبولوز بیس فسفات جذب می كند. این واكنش كه محدود كنندة سرعت عمل آنزیم است مولكول اندیولات تولید می كند كه این مولكول در حملة هسته دوستی به مولكول گازكربنیك شركت می كند. در نتیجة این واكنش، ملكول بتاستواسید به دست می آید كه بالافاصله از كربن شمارة‌4 مورد حملة آب قرار می گیرد و به یك تركیب 6 كربنه حد واسط تبدیل شده كه این تركیب به دو مولكول سه كربنه شكسته می شود . محصول نهایی این فرایند دو مولكول 3- فسفوگلیسرات یا PG3 است. نیروی محركة تولید مولكول های PG3 واكنش تجزیه تركیب حدواسط بتاستواسید می باشد كه این واكنش می تواند در شرایط استاندارد و PH فیزیولوژیك (7=Ph) انرژی معادل 1/35 كیلو ژول بر مول تولید نمید.

شكل شمارة‌220 نشان می دهد كه پروتئین  دارای ساختمان چهار بعدی است و محورهای چهارتایی آن به طرف بیننده می باشد. همچنین ساختمان یك زیر واحد بزرگ پروتئین را نشان می دهد كه در آن دو نوع پروتئین  و  دو قسمت غالب پروتئین را تشكیل می دهند.

واكنش ریبولوز بیس فسفات كربوكسیلاز از طریق تولید یك تركیب حد واسط اندیولات انجام می گیرد كه با شركت در یك حملة ‌نوكلئوفیلی به گاز كربنیك  یك بتا ستواسید تولید می گردد.

آنزیم ریبولوز بیس فسفات كربوكسیلاز برای فعالیت، نیاز به یون منیزیم دارد و احتمالاً در پایدار كردن بارهای منفی كه در جریان كاتالیز تولید می شوند، شركت می كند. یون منیزیم همچنین با یك گروه مهم كاتالیزوری به نام گروه كاربتامات (-NH-COO-) پیوند می یابد.

3- گلیسرآلدئید-3- فسفات پیش ساخت گلوكز –1- فسفات و سایر فراورده های بیوسنتزی است.

مجموعة واكنش های چرخة كلوین را می توان در معادلة ذیل خلاصه كرد:

محصول اولیة ‌فتوسنتز، یعنی گلیسرآلئید –3- فسفات در راهای متنوع متابولیكی خارج و یا داخل كلروپلاست مورد استفاده قرار می گیرد. به عنوان مثال به كمك آنزیم های دیگر راه كلوین، این مولكول می تواند به فروكتوز –6- فسفات و سپس به كمك آنزیم های فسفوگلوكز ایزومراز و فسفوگلوكومیوتاز به گلوكز –1- فسفات تبدیل شود. گلوكز –1-فسفات، پیش ساخت قندهای دیگر در گیاهان به حساب می آید، كه مهمترین این قندها عبارتند از ساكاروز (مهمترین قند حامل برای تحویل كربوهیدرات ها به سلولهای غیرفتوسنتزی)، نشاسته (پلی ساكارید اصلی ذخیرهای گیاه) و سلولز (سازندة‌ ساختمان دیوارة ‌سلولی سلول های گیاهی). با توجه به نوع گیاه و راه متابولیكی، مادة‌ مورد اثر آنزیم یعنی گلوكز –1-فسفات با تشكیل یكی از تركیبات مانند –GDP,-CDP,-ADP و یا –UDP گلوكز فعال می شود. واحد گلوكز در نهایت به پایانة یك زنجیر پلی ساكاریدی در حال رشد اضافه می گردد.

ب- كنترل چرخة كلوین: گیاهان در طول روشنایی روز، انرژی مورد نیاز خود را از طریق انرژی نوری و انرژی واكنش های فتوسنتز كه در پناه نور (تاریكی) انجام می گیرند تأمین می كنند و در طول شب و تاریكی، مانند سایر موجوات زنده،‌ باید از انرژی ذخیره ای خود برای تولید مولكول های پرانرژی مانند ATP و NADPH از طریق راههای متابولیكی گلیكولیز، فسفوریلاسیون اكسیدی و پنتوز فسفات استفاده كنند. به علت اینكه استرومای كلروپلاست حاوی آنزیم های راه گلیكولیز، پنتوز فسفات و همچنین چرخة كلوین است، بنابراین باید یك راهكار كنترل حساس به نور در استروما باشد تا از هدر دادن محصولات فتوسنتز جلوگیری نماید.

مطالعات نشان می دهد كه كنترل مواد ورودی به یك راه متابولیكی از طریق تنظیم فعالیت آنزیم مربوط به واكنش هایی انجام می گیرد كه از حالت تعادل، بسیار فاصله دارند‌، یعنی تغییرات انرژی آزاد آنها بسیار منفی است. از جدول شمارة‌37 می توان چنین استباط كرد كه بهترین واكنش هایی كه می تواند در كنترل چرخة كلوین دخالت نمایند واكنش های شمارة 2، و 10 از شكل شمارة 219 می باشند كه به ترتیب توسط سه آنزیم RuBP كربوكسیلاز، FBPase و SBPase كاتالیز می شوند. در حقیقت راندمان كاتالیزری این سه آنزیم در شرایط موجود زنده از یكدیگر متفاوت می باشد.

فعالیت آنزیم ریبولوز بیس فسفات كربوكسیلاز بستگی به سه عامل وابسته به نور دارد:

1- PH : در روشنایی به علت پمپ شدن پروتون از استروما به طرف حفرة داخلی تیلاكوئید، PH استروهمای كلروپلاست گیاه تقریباً از 0/7 به 0/8 افزایش می یابد. بهترین PH فعالیت آنزیم ریبولوز بیس فسفات كربوكسیلاز نزدیك به 8 است.

2- غلظت یون منیزیم: پروتون هایی كه در اثر تابش نور به حفرة داخلی تیلاكوئید منتقل می شوند در مقابل باعث حركت و خروج یون های منیزیم از حفرة داخلی به طرف استروما می گردند. یون های منیزیم خروجی از حفرة داخلی تیلاكوئید در تحریك فعالیت آنزیم ریبولوز بیس فسفات كربوكسیلاز دخالت دارند.

3- در بسیاری از گیاهان تركیبی به نام –2 كربوكسی آرابینیتول –1- فسفات یا CA1P تولید می شود كه این تركیب از فعالیت ریبولوز بیس فسفات كربوكسیلاز یا RuBP فقط در تاریكی جلوگیری می كند. (شكل شمارة 222).

آنزیم های FBPase و SBPaseبا افزایش PH و غلظت یون منیزیم و همچنین NADPH می شوند. تأثیر این عوامل توسط یك سیستم كنترل كنندة ثانویه كه به پتانسیل اكسیداسیون و احیای استروما پاسخ می دهد، كامل می شود. یك نوع پروتئین با وزن مولكولی 12 كیلودالتون به نام تیوردوكسین كه در اغلب انواع سلول ها وجود دارد، حاوی یكگروه دی سولفیدی سیستین(Cystine) می باشد كه به وط برگشت پذیری احیا می شود. تیوردوكسین احیاشده، هردو آنزیم FBPase و SBPase را به كمك یك واكنش تعویض دی سولفیدی فعال می سازد (شكل شمارة‌223). سطح اكسیداسیون و احیای تیوردوكسین توسط دومین آنزیم حاوی دی سولفید به نام فرودكسین- تیوردوكسین رداكتاز ابقا می شود. این آنزیم به طور مستقیم به وضعیت و حالت اكسیداسیون و احیای فرودوكسین محلول پاسخ می دهد. اندازة‌ این پاسخ به میزان روشنای بستگی دارد. سیستم تیوردوكسین همچنین آنزیم فسفوفوركتوكییناز یا PFK را غیرفعال می سازد. این آنزیم مهمترین عامل انجام واكنش های متابولیكی گلیكولیز به حساب می آید. بنابراین در گیاهان، نور باعث تحریك چرخة كلوین می شود ولی از فعالیت گلیكولیز جلوگیری می نماید، در حالی كه تاریكی اثر معكوس دارد و به همین علت معروف است كه واكنش های فتوسنتزی تاریكی در تاریكی انجام نمی گیرند.

شكل شمارة‌223- نحوة عمل فعال سازی آنزیم های FBPase و SBPase به كمك نور، فتوسیستم I كه در اثر نور فعال شده است فرودوكسین (Fd) محلول را احیا می كند.

شكل شمارة‌223 نشان می دهد كه چگونه فردوكسین احیا شدة آنزیم فرودكسین- تیورودكسین رداكتاز را احیا می سازد  و این آنزیم به نوبة ‌خود پیوند دی سولفیدی تیورودكسین را احیا می كند. تیوردوكسین احیا شده به كمك تعویض دی سولفید، یا بیس فسفاتاز غیرفعالی وارد واكنش می شود و در نتیجه این آنزیم كنترل كنندة چرخة كلوین را فعال می سازد.

ج- تنفس نوری: ازسال 1960 میلادی این موضوع شناخته شده بود كه گیاهان در روشنایی از طریق یك راه متابولیكی، جدای از فسفوریلاسیون اكسیدی، اكسیژن مصرف می كند و گازكربنیك خارج می سازند. در حقیقت در سطح پایین گازكربنیك و سطح بالای اكسیژن، فرایند تنفس نوری بر تثبیت گازكرینیك از راه فتوسنتز برتری می یابد. اساس و پایة ‌پدپدة تنفس نوری غیر قابل انتظار است: اكسیژن و گازكربنیك به عنوان مواد مورد اثر آنزیم ریبولوز بیس فسفات كربوكسلاز با هم رقابت می كنند، به همین دلیل این آنزیم را همچنین ریبولوز بیس فسفات كربوكسیلاز- اكسیژناز یا روبیسكو نیز می نامند. در واكنش اكسیژناز،‌ اكسیژن با ماده مورد اثر دیگر آنزیم،‌ یعنی ریبولوز بیس فسفات ، وارد واكنش می گردد و مولكول های 3- فسفوگلیسرات یا pg3 و 2- فسفوگلیكولات را تولید می كند (شكل شمارة ‌224). 2- فسفوگلیكولات به كمك آنزیم های مخلتف در پراكسی زوم و میتوكندریون تا حدودی اكسید شده و به گاز كربنیك تبدیل می شود. بنابراین تنفس نوری، قسمتی از كارهای فرآیند فتوسنتز را بی اثر می سازد.

1- تنفس نوری،‌ مولكول های ATP  و NADPH را از بین می برد- راه متابولیكی تنفس نوری در شكل شمارة‌ 225 نشان داده شده است . مولكول گلیكولات از كلروپلاست وارد پراكسی زوم یا گلی اكسی زوم می شود و در آنجا به كمك آنزیم گلیكولات اكسیداز اكسیده شده و به گلی اكسیلات و پراكسید هیدروژن  تبدیل می گردد. پراكسید هیدروژن عامل اكسید كنندة خطرناكی است كه به كمك یك آنزیم حاوی هم به نام كاتالاز به آب و اكسیژن تجزیه می شود. گلی اكسیلات می تواند در یك واكنش انتقال عامل آمین به گلیسین تبدیل شده و وارد میتوكندی گردد. در داخل میتوكندری دو مولكول گلیسین به یك مولكول سرین و یك مولكول گازكربنیك تبدیل می شود. این واكنش منبع تولید گازكربنیك در تنفس نوری به حساب می آید. اسید آمینة سرین مجدداً به داخل پراكسی زوم بر می گردد و در آنجا یك واكنش انتقال عامل آمینی، آن را به هیدروكسی پیرووات تبدیل می كند.

در ادامة راه متابولیكی تنفس نوری هیدروكسی پیرووات، در داخل پراكسی زوم، به كمك آنزیم هیدوكسی پیرووات رداكتاز، احیا شده و به گلیسرات تبدیل می شود. در داخل سیتوزول، گلیسرات فسفوریله شده و به 3-فسفوگلیسرات تبدیل می شود و این تركیب مجدداً وارد كلروپلاست می گردد و در آنجا توسط چرخة كلوین به مادة اولیه، یعنی ریبولوز بیس فسفات تبدیل می گردد. نتیجة نهایی این چرخة پیچیدة تنفس نوری این است كه مقداری از مولكول های پرانرژی ATP  و NADPH كه توسط واكنش های نوری فتوسنتز تولید شده بودند، بدون اینكه مورد استفاده گیاه قرار بگیرند، از بین می روند. 

مهندسی کشاورزی