بررسی شاخص های پیری و ردیابی ژن آلفامانوزیداز مرتبط با پیری در چند رقم گیلاس

این کار تحقیقی در دو بخش بیوشیمیایی و بیوتکنولوژی در محل آزمایشگاه علوم باغبانی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان انجام شد. در بخش بیوشیمیایی، جهت بررسی تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر شاخص­های کیفی و روند پیری دو رقم زودرس و دیررس گیلاس، آزمایشی فاکتوریل در قالب طرح بلوک­های کامل تصادفی و در چهار تکرار صورت گرفت. تیمار اول، رقم (کرج و تکدانه) و تیمار دوم، اسید آبسیزیک (در دو غلظت صفر و ppm200) مورد بررسی قرار گرفتند. میوه­ها در فواصل زمانی پنج روز و طی مدت 20 روز از زمان برداشت، از لحاظ تغییرات صفات کیفی ارزیابی شدند. طبق نتایج بدست آمده، با گذشت زمان، سفتی در هر دو رقم کاهش یافته، و در نمونه­های تیمار شده با اسید آبسیزیک کاهش بیشتری نشان داد. میزان آنتوسیانین روند افزایشی داشت. میزان کلروفیل کل و کاروتنوئید دم میوه­ها با گذشت زمان به طور معنی­داری کاهش یافت. مواد جامد محلول میوه­ها تا روز دهم کاهش و در روز پانزدهم افزایش پیدا کرد. اسیدیته میوه­ها روند نزولی داشت و در روز بیستم اختلاف معنی­داری بین نمونه­های تیمار شده و تیمار نشده مشاهده شد. با گذشت زمان در میزان قند کل میوه­ها تغییر معنی­داری مشاهده نشد اما به طور کلی تغییرات قند کل دارای روند افزایشی بود. روند تغییرات فروکتوز برای نمونه­های تیمار شده و تیمار نشده با اسید آبسیزیک، در رقم کرج معنی­دار نبود اما بین رقم تکدانه تیمار شده و تیمار نشده با اسید آبسیزیک اختلاف معنی­داری در روز 15 و 20 مشاهده گردید. با توجه به این نتایج، می­توان نقش اسید آبسیزیک را در ایجاد تغییرات کیفی و همچنین تاثیر بر روند پیری میوه­ها، مورد توجه قرار داد. در بخش بیوتکنولوژی، ژن آلفامانوزیداز (یک ژن مرتبط با پیری) برای اولین بار، در پنج رقم مختلف گیلاس شناسایی و تعیین توالی شد. به این منظور، آغازگرهای رفت و برگشت ژن مورد نظر از طریق مراجعه به پایگاه داده NCBI و استفاده از توالی­های مربوط به ژن آلفامانوزیداز برای هلو و فلفل، با استفاده از کپی کامل cDNA هلو و فلفل طراحی شد. به علت زیاد بودن طول ژن سه جفت آغازگر طراحی شد گه این آغازگرها قادرند طول 3100 جفت­باز را پوشش دهند. همچنین دمای اتصال آغازگرها با استفاده از برنامه گرادیانت PCR بدست آمد. بعد از استخراج DNA ارقام گیلاس، یک قسمت از ژن مذکور تکثیر، توالی­یابی (با استفاده از نرم­افزار سنگر) و همردیف­سازی توالی­ها انجام شد و نمودار دندروگرام مربوط به آن با استفاده از نرم‌افزار 3 View رسم گردید. بررسی و مقایسه توالی­های معکوس، شباهت و تفاوت­هایی را در ارقام مختلف نشان داد که بر طبق آن ارقام پیش­رس (ER)، پیش­رس خارجی (FE) و دیررس (LR) دارای شباهت بیشتر بوده و در یک گروه قرار گرفتند. ارقام پیش­رس قزوین (GH) و دوم­رس (MR) دارای تفاوت بیشتری نسبت به سه رقم اول بوده و با یکدیگر نیز تفاوت نشان داده و هرکدام به طور جداگانه یک گروه مجزا را تشکیل دادند.این تفاوت­ها می­توانند در عملکرد ژن و در نتیجه رفتار گیاه تاثیرگذار باشند. به عنوان مثال، با مطالعات بیشتر و استفاده از تکنیک­های مهندسی ژنتیک، می­توان علت زمان­های متفاوت رسیدگی و تفاوت در طول عمر انبارمانی موجود در ارقام مختلف گیلاس را در این اختلاف توالی‌ها جستجو نمود.

واژه­های کلیدی: گیلاس، اسید آبسیزیک، پیری، آلفامانوزیداز

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                صفحه

 1- مقدمه و كلیات............................... 2

1-1- مقدمه................................... 2

1-2- اهداف................................... 3

1-3- فرضیه­ها................................. 4

2- سابقه تحقیق................................. 6

2-1- خاستگاه و گیاهشناسی گیلاس................ 6

2-2- طبقه­بندی ارقام گیلاس..................... 7

2-3- کیفیت میوه.............................. 7

2-3-1- آنتوسیانین.......................... 7

2-3-2- اسیدیته............................. 8

2-3-3- مواد جامد محلول..................... 8

2-3-4- سفتی بافت........................... 9

2-3-5- کلروفیل و کاروتنوئید................ 9

2-3-6- کربوهیدرات­ها....................... 10

2-4- بلوغ و رسیدگی در گیلاس.................. 10

2-5- انبارمانی گیلاس......................... 11

2-6- فیزیولوژی تنفس......................... 12

2-7- اسید آبسیزیک........................... 13

2-8- پیری................................... 14

2-9- کنترل ژنتیکی متابولیسم گیاه............ 14

2-10- آنزیم آلفامانوزیداز و نقش آن در رسیدگی 15

3- مواد و روش کار............................. 18

3-1- زمان و مکان آزمایش..................... 18

3-2- بخش بیوشیمیایی......................... 18

3-2-1- مواد گیاهی......................... 18

3-2-2- طرح آماری آزمایش................... 18

3-2-3- اندازه­گیری سفتی.................... 19

3-2-5- اندازه­گیری آنتوسیانین.............. 19

3-2-6- اندازه­گیری کلروفیل دم میوه......... 19

3-2-7- اندازه­گیری مواد جامد محلول میوه.... 21

3-2-8- اندازه­گیری اسیدیته قابل تیتراسیون میوه 21

3-2-9- اندازه­گیری قند..................... 21

3-2-9-1- مواد مورد نیاز................. 21

3-2-9-2- استخراج قند.................... 22

3-2-9-3- اندازه­گیری قند کل.............. 22

3-2-9-4- منحنی استاندارد قند کل......... 23

3-2-9-5- اندازه­گیری فروکتوز............. 23

3-2-9-6- تهیه نمودار استاندارد فروکتوز.. 24

3-3- بخش بیوتکنولوژی........................ 25

3-3-1- مواد گیاهی......................... 25

3-3-2- استخراج DNA........................ 25

3-3-3- طراحی آغازگرها..................... 26

3-3-4- تکثیر قطعات انتخابی................ 27

3-3-5- ارزیابی محصول PCR به وسیله تکنیک الکتروفورز ژل آگارز     28

3-3-6- توالی­یابی محصول PCR................. 28

3-4- تجزیه و تحلیل آماری.................... 28

4- نتایج و بحث................................ 30

4-1- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر سفتی میوه گیلاس    30

4-2- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر تغییرات آنتوسیانین میوه گیلاس.......................................... 33

4-3- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر کلروفیل کل و کاروتنوئید دم میوه گیلاس.................................. 36

4-4- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر میزان مواد جامد محلول میوه گیلاس..................................... 42

4-5- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر میزان اسیدیته قابل تیتراسیون میوه گیلاس........................... 45

4-6- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر میزان قند کل و فروکتوز میوه گیلاس..................................... 48

4-7- استخراج DNA............................ 53

4-8- نتایج حاصل از طراحی آغازگر............. 54

4-9- تکثیر ژن آلفامانوزیداز در پنج رقم گیلاس. 54

4-10- بررسی نتایج حاصل از توالی­یابی و همردیف­سازی توالی­های بدست آمده   56

4-11- روابط فیلوژنی توالی­های مورد بررسی..... 60

4-12- نتیجه­گیری کلی......................... 61

4-13- پیشنهادات............................. 62

فهرست منابع................................... 64

فهرست جدول‌ها

جدول 3-1- مشخصات آغازگر رفت و برگشت طراحی شده برای تکثیر ژن آلفامانوزیدار.............................................. 27

جدول 3-2- مواد و مقادیر مورد نیاز در واکنش PCR 27

جدول 4-1- تجزیه واریانس تیمارهای اعمال شده بر سفتی میوه گیلاس   31

جدول 4-2- تجزیه واریانس تیمارهای اعمال شده بر آنتوسیانین میوه گیلاس  35

جدول 4-3- تجزیه واریانس تیمارهای اعمال شده بر کلروفیل دم میوه گیلاس  39

جدول 4-4- تجزیه واریانس تیمارهای اعمال شده بر کاروتنوئید دم میوه گیلاس    39

جدول 4-5- تجزیه واریانس تیمارهای اعمال شده بر مواد جامد محلول میوه گیلاس  43

جدول 4-6- تجزیه واریانس تیمارهای اعمال شده بر اسیدیته قابل تیتراسیون میوه گیلاس.......................................... 46

جدول 4-7- تجزیه واریانس تیمارهای اعمال شده بر قند کل میوه گیلاس 50

جدول 4-8- تجزیه واریانس تیمارهای اعمال شده بر فروکتوز میوه گیلاس     50

جدول 4-9- مثال‌هایی از بررسی و مقایسه توالی بین نوکلئوتید 260 تا 380 در پنج رقم گیلاس...................................... 56

فهرست شكل‌ها 

شکل 3-1- منحنی استاندارد بدست آمده برای قند کل 23

شکل 3-2- منحنی استاندارد بدست آمده برای قند کل 24

شکل 4-1- تاثیر تیمار اسید آبسیزیک بر سفتی میوه طی 20 روز پس از برداشت   32

شکل 4-2- مقایسه سفتی میوه گیلاس در دو رقم کرج و تکدانه طی 20 روز پس از برداشت........................................ 32

شکل 4-3- اثر متقابل اسید آبسیزیک و رقم بر سفتی میوه طی 20 روز پس از برداشت.............................................. 33

شکل 4-4- تاثیر تیمار اسید آبسیزیک بر آنتوسیانین میوه طی 20 روز پس از برداشت........................................ 35

شکل 4-5- اثر متقابل اسید آبسیزیک و رقم بر آنتوسیانین میوه طی 20 روز پس از برداشت........................................ 36

شکل 4-6- مسیر تولید اسید آبسیزیک.............. 38

شکل 4-7- تاثیر تیمار اسید آبسیزیک بر کلروفیل کل دم میوه طی 20 روز پس از برداشت........................................ 39

شکل 4-8- مقایسه کلروفیل کل دم میوه گیلاس در دو رقم کرج و تکدانه طی 20 روز پس از برداشت.................................. 40

شکل 4-9- تاثیر تیمار اسید آبسیزیک بر کاروتنوئید دم میوه طی 20 روز پس از برداشت........................................ 40

شکل 4-10- مقایسه کاروتنوئید دم میوه گیلاس در دو رقم کرج و تکدانه طی 20 روز پس از برداشت.................................. 41

شکل 4-11- اثر متقابل اسید آبسیزیک و رقم بر کلروفیل کل دم میوه طی 20 روز پس از برداشت..................................... 41

شکل 4-12- اثر متقابل اسید آبسیزیک و رقم بر کاروتنوئید دم میوه طی 20 روز پس از برداشت..................................... 42

شکل 4-13- تاثیر تیمار اسید آبسیزیک بر مواد جامد محلول میوه طی 20 روز پس از برداشت........................................ 44

شکل 4-14- مقایسه مواد جامد محلول میوه گیلاس در دو رقم کرج و تکدانه طی 20 روز پس از برداشت.............................................. 44

شکل 4-15- اثر متقابل اسید آبسیزیک و رقم بر مواد جامد محلول میوه طی 20 روز پس از برداشت.................................. 45

شکل 4-16- تاثیر تیمار اسید آبسیزیک بر اسیدیته قابل تیتراسیون میوه طی 20 روز پس از برداشت.............................. 47

شکل 4-17- مقایسه اسیدیته قابل تیتراسیون میوه گیلاس در دو رقم کرج و تکدانه طی 20 روز پس از برداشت........................ 47

شکل 4-18- اثر متقابل اسید آبسیزیک و رقم بر اسیدیته قابل تیتراسیون میوه طی 20 روز پس از برداشت........................... 48

شکل 4-19- مقایسه قند کل میوه گیلاس در دو رقم کرج و تکدانه طی 20 روز پس از برداشت........................................ 50

شکل 4-20- تاثیر تیمار اسید آبسیزیک بر فروکتوز میوه طی 20 روز پس از برداشت.............................................. 51

شکل 4-21- مقایسه فروکتوز میوه گیلاس در دو رقم کرج و تکدانه طی 20 روز پس از برداشت........................................ 51

شکل 4-22- اثر متقابل اسید آبسیزیک و رقم بر قند کل میوه طی 20 روز پس از برداشت........................................ 52

شکل 4-23- اثر متقابل اسید آبسیزیک و رقم بر فروکتوز میوه طی 20 روز پس از برداشت........................................ 52

شکل 4-24- DNA استخراج شده از پنج رقم گیلاس..... 53

شکل 4-25- DNA استخراج شده از پنج رقم گیلاس..... 53

شکل 4-26- نتایج حاصل از طراحی آغازگر.......... 54

شکل 4-27- نتایج حاصل از تکثیر ژن آلفامانوزیداز در پنج رقم گیلاس.    55

شکل 4-28- نتایج حاصل از تکثیر ژن آلفامانوزیداز در پنج رقم گیلاس.    55

شکل 4-29- نتایج حاصل از تکثیر ژن آلفامانوزیداز در پنج رقم گیلاس.    55

شکل 4-30- نتایج حاصل از همردیف­سازی توالی معکوس. 57

شکل 4-31- نتایج حاصل از همردیف­سازی توالی معکوس. 58

شکل 4-32- نتایج حاصل از همردیف­سازی توالی معکوس. 59

شکل 4-33- دندروگرام مربوط به روابط ژنتیکی پنج رقم گیلاس.   60