پایان نامه کارشناسی ارشد بیوتكنولوژی و زیست شناسی با عنوان كوآنزیم

زیست
دانلود پایان نامه کارشناسی ارشد بیوتكنولوژی و زیست شناسی با عنوان كوآنزیم چكیده: ایزوپرنوئیدها از بزرگترین تركیبات آلی در طبیعت بوده كه دارای نقشهای گوناگون بیولوژیكی در بدن موجودات زنده از جمله انسان می باشند، از اینرو این تركیبات از اهمیت بسیار بالایی از نظر پزشكی و غذایی و حتی دارویی برخوردار هستند. از جمله مهمترین این تركیبات می توان به یوبی كینونها اشاره نمود كه هنگام تنفس سلولی در زنجیره انتقال الكترون دارای نقش بسیار مهمی می باشند. این تركیبات هموپلیمرهایی از واحدهای ایزوپرنی به نام ایزوپنتیل پیرو فسفات (IPP) با ویژگی های ساختاری و فیزیكوشیمیایی مختلف هستند. دو آنزیم "فارنزیل دی فسفات سنتاز" و "ژرانیل ژرانیل دی فسفات سنتاز" مسئول بیوسنتز دو تركیب "فارنزیل دی فسفات" و "ژرانیل ژرانیل دی فسفات" كه به ترتیب هر كدام از 3 و 4 واحد ایزوپرنی تشكیل شده اند. این تركیبات می توانند به عنوان سوبسترا جهت سنتز دیگر تركیبات ایزوپرنوئیدی و از جمله كوآنزیم Q10 مورد استفاده قرار گیرند.در این مطالعه، تاثیر بیان ژنهای کد کنندهء آنزیم "ژرانیل ژرانیل دی فسفات سنتاز" به تنهایی و یا همراه با دیگرآنزیمهای مسیر بیوسنتز لیكوپن بر روی آنزیم "دکاپرنیل دی فسفات سنتاز" ( آنزیم مسئول ساخت زنجیرهء ایزوپرنوئید كوآنزیم Q10 ) و در نهایت تولید كوآنزیم Q10 در سویه های نوتركیب باكتری "اشرشیاكلی " مطالعه می گردد. کلمات کلیدی: Coenzyme كوآنزیم ایزوپرنوئیدها تركیبات آلی دكاپرنیل دی فسفات سنتاز آگروباكتریوم تومی فاسینس ردوباكتر اسفروئیدس مواد و روشها: در این پژوهش ژنهای هترولوگوس كد كننده آنزیم "دكاپرنیل دی فسفات سنتاز" (dds) از دو گونهء باكتریایی "آگروباكتریوم تومی فاسینس" (atdds) و "ردوباكتر اسفروئیدس" (rsdds) استخراج شده و بوسیلهء دو پلاسمید جداگانه به درون باكتری اشرشیاكلی سویه DH5α كلون گردیدند كه نتیجهء آن ایجاد توانایی تولید كوآنزیم Q10 در این باكتری بود. در ادامه میزان تولید این تركیب در سلولهای نو تركیب حاصله با دستگاه HPLC مورد ارزیابی قرار گرفت. به منظور مطالعه اثر آنزیم "ژرانیل ژرانیل دی فسفات سنتاز" به تنهایی و یا همراه با دیگر آنزیمهای مسیر بیوسنتز لیكوپن بر روی تولید كوآنزیم Q10 نیز؛ ژنهای مربوطه ( crtE, crtB, crtI ) از باكتری "اروینیا هربیكولا" استخراج شده و بوسیله پلاسمیدهای جداگانه به درون سلولهای نوتركیب اشرشیاكلی تولید كنندهء كوآنزیم Q10 كلون گردیدند. سلولهای نوتركیب حاصله در محیط كشت "2YTG" در دمای 30 درجه سانتی گراد كشت داده شدند و سپس تولید كوآنزیم Q10 در هر سلول مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج: بیان دو ژن atdds و rsdds در باكتری اشرشیاكلی با شناسایی پیك كوآنزیم Q10 توسط دستگاه HPLC مورد تائید قرار گرفت. بطور كلی برای شناسایی و اندازه گیری كوآنزیم Q ها از یك شناساگر اشعهء UV در طول موج 275 نانومتر استفاده می شود.به منظور اندازه گیری غلظت كوآنزیم Q10 تولید شده در سلولهای نوتركیب نیز از منحنی استاندارد كوآنزیم Q10 استفاده گردید.نتایج بدست آمده نشان داد كه بیان ژن كدكنندهء آنزیم "ژرانیل ژرانیل دی فسفات سنتاز" به تنهایی در باكتری نوتركیب اشرشیاكلی كه حاوی یكی از دو ژن atdds و یا rsdds می باشد ، افزایش چشمگیری در میزان تولید كوآنزیم Q10 ایجاد نمی نماید و حتی در بعضی موارد منجر به كاهش تولید نیز می گردد. از طرف دیگر بیان ژن كدكننده آنزیم "ژرانیل ژرانیل دی فسفات سنتاز" همراه با بیان ژهای كدكنندهء آنزیم های "فیتوئن سنتاز" و "فیتوئن دساتوراز" ، كه همگی در مسیر بیوسنتز لیكوپن وجود دارند، منجر به مشاهدهء نتایج متفاوتی در میزان تولید كوآنزیم Q10 در سلولهای نوتركیب حاوی atdds و یا rsdds شده است. بطوریكه بیان ژنهای كدكنندهء مسیر بیوسنتز لیكوپن زمانی كه با ژن atdds همراه هستند، اثر قابل توجهی در میزان تولید كوآنزیم Q10 نمی گذارند، در حالیكه وقتی این ژنها با ژن rsdds همراه می شوند منجر به افزایش چشمگیری در تولید این تركیب می گردند. فهرست مطالب چكیده فصل اول (كلیات) 1 1.مقدمه : 2 2.تاریخچه كوآنزیم Q10: 3 3.بررسی ساختمان كوآنزیم Q: 3 4. بررسی واکنشهای اکسیداسیون و احیاء در كوآنزیم Q10 : 5 5.مسیر بیوسنتز" كوآنزیم Q10 : 7 5-1 مسیر سنتز زنجیرهء ایزوپرنوئیدی: 10 5-2 ساخت حلقهء یوبی كینونی: 11 5-3 اتصال حلقه به زنجیرهء ایزوپرنوئیدی و تغییرات بعدی آن: 11 6.بررسی آنزیم های کلیدی در مسیر سنتز کوآنزیمQ10 : 15 7. تاثیر مسیر بیوسنتز ایزوپرنوِِئیدها برروی تولید یوبی كینون ها: 22 7-1 مسیر بیوسنتز لیكوپن: 23 8.نقص كوآنزیم Q10 : 26 9.نقش كوآنزیم Q10 : 27 10 اثرات داروهای استاتینی بر روی بیوسنتز كوآنزیم Q10: 37 11 اهداف پژوهش : 40 12. استراتژی پژوهش : 41 13. نكات مهم پژوهش : 49 فصل دوم (مواد و روشها) 51 ◙ مواد مورد استفاده در این پژوهش: 52 1 اسامی ژن های مورد استفاده: 52 اسامی پلاسمید های مورد استفاده: 52 3 آنزیم های مورد استفاده: 53 4 دستگاههای مورد استفاده در این پژوهش: 53 5 كیت های مورد استفاده در این پژوهش: 56 6 مواد ومحلول های مورد استفاده در این پژوهش : 57 ◙ روش ها: 60 1. تهیه انواع محیط كشت: 60 2. استفاده از انواع آنتی بیوتیك ها در محیط های كشت : 63 3. تهیه سلول مستعد: 64 4. انتقال ژن خارجی به سلول های مستعد : 67 5. تكنیك PCR: 69 6 الكتروفورز با ژل آگارز : 73 7. خالص سازی ژن از ژل آگارز : 79 8 استفاده از آنزیم های برش دهنده: 81 9. خالص سازی نمونه DNA از آنزیم های موجود در محیط واكنش: 84 10 استخراج پلاسمید : 85 11. استخراج كوآنزیم Qاز باكتری تولید كننده: 88 12. محاسبه وزن خشك سلول : 91 13. دستگاه "pH متر": 92 14. دستگاه "اسپكتروفتومتر" : 93 .15. دستگاه تبخیر كننده: 94 16 كروماتوگرافی "HPLC": 94 فصل سوم (نتایج) 98 1.ساخت پلاسمیدهای نوترکیب: 99 1-1. ساخت پلاسمید "pDcrtE" 99 1-2. ساخت پلاسمید "pTcrtE" : 107 1-3. ساخت پلاسمید "pTlycm3" 110 1-4.ساخت پلاسمید "pBrsdds" : 118 1-5. تکثیر پلاسمید "pBatdds" 126 2. ساخت سلولها: 127 2-1 ساخت سلول E.coli-Ba: 128 2-2 ساخت سلول E.coli-Br: 129 2-3 ساخت سلول E.coli-BaDc: 129 2-4. ساخت سلول E.coli-BrDc: 129 2-5. ساخت سلول E.coli-BaTc: 129 2-6. ساخت سلول E.coli-BrTc: 130 2-7. ساخت سلول E.coli-BaTl: 130 2-8. ساخت سلول E.coli-BrTl: 130 3 اندازه گیری كوآنزیمQ10 سنتز شده در سلولهای نوتركیب: 130 3-1 انتقال سلول ها به محیط كشت : 131 3-2 استخراج كوآنزیم Qسنتز شده از سلول های نوترکیب: 133 3-3 اندازه گیری كوآنزیم Q با روش كروماتوگرافی "HPLC" : 133 4.نتایج و یافته ها : 141 5 بحث و بررسی : 146 6. پیشنهادات: 150 فصل چهارم (منابع) 151 منابع انگلیسی : 152 منابع فارسی: 162 فهرست تصاویر فصل اول تصویر شماره 1-1 شمای ساختار انواع كوآنزیم Q ...................................................................3 تصویر شماره 1-2 شمای ساختار كوآنزیم Q3 .........................................................................4 تصویر شماره 1-3 شمای ساختار سمی كینون ..........................................................................5 تصویر شماره 1-4 شمای ساختار یوبی كینول ..........................................................................5 تصویر شماره 1-5 سیكل كوآنزیم Q ......................................................................................6 تصویر شماره 1-6 شمای مسیر موالونات و غیر موالونات تا سنتز كوآنزیم Q10...............................9 تصویر شماره 1-7 شمای ساخت حلقه یوبی كینونی ....................................................................11 تصویر شماره 1-8 مسیر سنتز كوآنزیم Q10 ...........................................................................12 تصویر شماره 1-9 مراحل بیوسنتز كوآنزیم Q در باكتری "اشرشیاكلی" و مخمر "ساكارومایسس سرویزیه".....13 تصویر شماره 1-10 مسیر بیوسنتز لیكوپن...............................................................................25 تصویر شماره 1-11 زنجیره انتقال الكترون در یوكاریوتها...........................................................29 تصویر شماره 1-12 شمای نقش كوآنزیم Q10 در شكل گیری باند دی سولفیدی ................................30 تصویر شماره 1-13 شمای نقش كوآنزیم Q10 به عنوان عامل اكسید كننده سولفید..............................31 تصویر شماره 1-14 شمای ارتباط مسیر سنتز كوآنزیم Q با مسیر سنتز كلسترول..............................38 تصویر شماره 1-15 شمای پلاسمید pBBR1MCS2................................................................43 تصویر شماره 1-16 شمای پلاسمید pBAD24 ........................................................................44 تصویر شماره 1-17 شمای عملكرد پروموتور آرابینوز در وكتور pBAD24...................................46 تصویر شماره 1-18 شمای پلاسمید pTrc99A .......................................................................46 فصل دوم تصویر شماره 2-1 تصویر محیط كشت جامد موجود در plate ....................................................60 تصویر شماره 2-2 دستگاه PCR .........................................................................................69 تصویر شماره 2-3 دستگاه الكتروفورز ..................................................................................73 تصویر شماره 2-4 دستگاه pH متر........................................................................................92 تصویر شماره 2-5 دستگاه اسپكتروفتومتر................................................................................93 تصویر شماره 2-6 دستگاه تبخیر كننده ...................................................................................94 تصویر شماره 2-7 دستگاه HPLC .......................................................................................95 فصل سوم تصویر شماره 3-1 توالی ژن crtE ......................................................................................100 تصویر شماره 3-2 شمای مراحل ساخت پلاسمید pDcrtE .........................................................101 تصویر شماره 3-3 نمای الكتروفورز ژل آگارز پلاسمید pBAD24 ..............................................101 تصویر شماره 3-4 شمای دو پرایمر برگشتی و پیشرونده برای تكثیر ژن crtE ................................103 تصویر شماره 3-5 نمای الكتروفورز ژل آگارز ژن crtE ..........................................................103 تصویر شماره 3-6 پلاسمید خطی شده pBAD24 .....................................................................104 تصویر شماره 3-7 نمای الكتروفورز ژل آگارز آماده سازی ژن و پلاسیمد برای ساخت پلاسمید pDcrtE ......105 تصویر شماره 3-8 شمای پلاسمید pDcrtE ............................................................................106 تصویر شماره 3-9 نمای الكتروفورز ژل آگارز كنترل پلاسمید pDcrtE........................................106 تصویر شماره 3-10 شمای مراحل ساخت پلاسمید pTcrtE .......................................................107 تصویر شماره 3-11 نمای الكتروفورز ژل آگارز پلاسمید pTrc99A ...........................................107 تصویر شماره 3-12 نمای الكتروفورز ژل آگارز پلاسمید خطی شده pTrc99A ..............................108 تصویر شماره 3-13 نمای الكتروفورز ژل آگارز آماده سازی ژن و پلاسیمد برای ساخت پلاسمید pTcrtE .....109 تصویر شماره 3-14 شمای پلاسمید pTcrtE ..........................................................................109 تصویر شماره 3-15 نمای الكتروفورز ژل آگارز كنترل پلاسمید pTcrtE ......................................110 تصویر شماره 3-16 توالی ژن crtB ....................................................................................111 تصویر شماره 3-17 توالی ژن crtI ...........................................................................112 و 113 تصویر شماره 3-18 شمای مراحل ساخت پلاسمید pTlycm3 .....................................................113 تصویر شماره 3-19 نمای الكتروفورز ژل آگارز پلاسمید pTlycm4 ............................................114 تصویر شماره 3-20 نمای الكتروفورز ژل آگارز 3 ژن موجود در پلاسمید pTlycm4 ......................115 تصویر شماره 3-21 نمای الكتروفورز ژل آگارز 3 ژن جدا شده از پلاسمید pTlycm4 .....................115 تصویر شماره 3-22 نمای الكتروفورز ژل آگارز آماده سازی ژن و پلاسیمد برای ساخت پلاسمید pTlycm4...116 تصویر شماره 3-23 نمای الكتروفورز ژل آگارز پلاسمید خطی شده pTrc99A پس از خالص سازی ...117 تصویر شماره 3-24 شمای پلاسمید pTlycm3 .......................................................................117 تصویر شماره 3-25 نمای الكتروفورز ژل آگارز كنترل پلاسمید pTlycm3 ...................................118 تصویر شماره 3-26 توالی ژن rsdds ..................................................................................119 تصویر شماره 3-27 شمای مراحل ساخت پلاسمید pBrsdds .....................................................120 تصویر شماره 3-28 نمای الكتروفورز ژل آگارز پلاسمید pTrsdds ............................................121 تصویر شماره 3-29 نمای الكتروفورز ژل آگارز ژن rsdds جدا شده از پلاسمید pTrsdds ...............122 تصویر شماره 3-30 نمای الكتروفورز ژل آگارز ژن rsdds خالص سازی شده ...............................122 تصویر شماره 3-31 نمای الكتروفورز ژل آگارز پلاسمید pBBR1MCS2 ...................................123 تصویر شماره 3-32 نمای الكتروفورز ژل آگارز پلاسمید خطی شده pBBR1MCS2 ......................124 تصویر شماره 3-33 نمای الكتروفورز ژل آگارز پلاسمید خطی شده pBBR1MCS2 خالص سازی شده.........124 تصویر شماره 3-34 شمای پلاسمید pBrsdds .........................................................................125 تصویر شماره 3-35 نمای الكتروفورز ژل آگارز كنترل پلاسمید pBrsdds ......................................125 تصویر شماره 3-36 توالی ژن atdds ..................................................................................126 تصویر شماره 3-37 شمای پلاسمید pBatdds ........................................................................127 تصویر شماره 3-38 شمای مراحل ساخت سلولهای نوتركیب .........................................................128 تصویر شماره 3-39 پیك مربوط به كوآنزیم Q10 استاندارد شناسایی شده توسط دستگاه HPLC ..........135 تصویر شماره 3-40 پیك مربوط به كوآنزیم Q8 استاندارد شناسایی شده توسط دستگاه HPLC ...........136 تصویر شماره 3-41 پیك مربوط به كوآنزیم Q9 استاندارد شناسایی شده توسط دستگاه HPLC ...........136 تصویر شماره 3-42 پیك كوآنزیم Q شناسایی شده در نمونه مجهول توسط دستگاه HPLC..................137 تصویر شماره 3-43 پیك كوآنزیم Q شناسایی شده در نمونه مجهول توسط دستگاه HPLC..................147 فهرست جداول فصل اول جدول شماره 1-1 انواع ژنهای كد كننده مسیر بیوسنتز كوآنزیم Q در "اشرشیاكلی" و "ساكارومایس سرویزیه".....15 جدول شماره 1-2 انواع آنزیم های "پلی پرنیل دی فسفات سنتاز".....................................................16 فصل دوم جدول شماره 2-1 نام ژنهای مورد استفاده به همراه ویژگی آنها ......................................................52 جدول شماره 2-2 نام پلاسمیدهای مورد استفاده...........................................................................52 جدول شماره 2-3 نام آنزیم های برش دهنده مورد استفاده..............................................................53 جدول شماره 2-4 آنتی بیوتیك های مورد استفاده.........................................................................63 جدول شماره 2-5 ویژگی كامل آنزیم های برش دهنده مورد استفاده..................................................83 جدول شماره 2-6 ویژگی كامل آنزیم DNA T4" لیگاز"..............................................................84 فصل سوم جدول شماره 3-1 اسامی پلاسمیدهای نوتركیب ساخته شده.............................................................99 جدول شماره 3-2 اسامی سلولهای نوتركیب ساخته شده.....................................................127 و 128 جدول شماره 3-3 اندازه سطح زیر منحنی نمونه كوآنزیم Q10 استاندارد در غلظتهای مختلف..............134 جدول شماره 3-4 غلظت كوآنزیم Q10 محاسبه شده در سلولهای نوتركیب ...........................137و 138 جدول شماره 3-5 وزن خشك سلولی محاسبه شده سلولهای نوتركیب.....................................139 و 140 جدول شماره 3-6 مقدار تولید كوآنزیم Q10 در سلولهای نوتركیب.................................................141 فهرست نمودارها فصل سوم نمودار شماره 3-1 منحنی استاندارد كوآنزیم Q10 ....................................................................135 نمودار شماره 3-2 منحنی استاندارد وزن خشك سلولی................................................................139 نمودار شماره 3-3 اثر ژن crtE ( بر روی وكتور pBAD24 ) در تولید كوآنزیم Q10 .....................142 نمودار شماره 3-4 اثر ژن crtE ( بر روی وكتور pTrc99A) در تولید كوآنزیم Q10 .....................143 نمودار شماره 3-5 اثر ژنهای مسیر بیوسنتز لیكوپن در تولید كوآنزیم Q10 .....................................144 نمودار شماره 3-6 اثر ژن crtE و ژنهای مسیر بیوسنتز لیكوپن به هراه ژن atdds در تولید كوآنزیم Q10...145 نمودار شماره 3-7 اثر ژن crtE و ژنهای مسیر بیوسنتز لیكوپن به هراه ژن rsdds در تولید كوآنزیم Q10....145 فهرست معادلات فصل اول معادله 1-1 معادله انتقال الكترون از كوآنزیم Q10 به كمپلكس بعد از آن ..........................................28 فصل دوم معادله 2-1 معادله محاسبه pH ..............................................................................................92 فصل سوم معادله 3-1 معادله محاسبه غلظت كوآنزیم Q10 تولید شده در سلولهای نوتركیب...............................140