علوم کشاورزی و منابع طبیعی
دانلود پایان نامه کارشناسی ارشد رشته کشاورزی بررسی تنوع ژنتیکی انواع سیب با استفاده از مارکر SSR چکیده: ثبت و شناسایی ارقام و پایه های گیاهی و تعیین رابطه ژنتیکی بین آنها مستلزم دسترسی به روشهای دقیق و قابل تکراری که از شرایط محیطی متأثر نباشد، می باشد. روشهای سنتی تعیین هویت بر اساس مشاهده ظاهری درخت و میوه است. با توجه به اینکه بسیاری از خصوصیات ظاهری تحت تأثیر عوامل محیطی قرار می گیرند، این روش قابل اعتماد نیست.با استفاده از نشانگرها در سطح ملکول DNA می توان اطلاعات دقیقی از ژنوم گیاهان بدست آورد.از جمله نشانگرهای معتبر در بررسی ژنوم سیب، نشانگر SSR است که بدلیل تکرارپذیری بالا، ایجاد الگوی باندی نسبتاً ساده و توارث همبارز در بررسی تنوع ژنتیکی و شناسه دار کردن ارقام و پایه های سیب کارایی بالایی دارد. در بررسی حاضر از 5 جفت نشانگر پلی مورفیک SSR بر روی 24 رقم و پایه سیب بمنظور تهیه شناسنامه ژنتیکی برای بعضی از ارقام و پایه ها و همچنین تعیین رابطه ژنتیکی بین آنها استفاده شد. نمونه های برگی از کلکسیون سیب جمع آوری و DNA آنها استخراج شدند و سپس با استفاده از نشانگرهای اختصاصی SSR مورد تکثیر قرار گرفتند. پس از الکتروفورز عمودی در دستگاه توالی یاب DNA در ژل پلی آکریل آمید و رنگ آمیزی نیترات نقره در مجموع 52 آلل پلی مورفیک در 5 لوکوس ریزماهوار ( میانگین 4/10 در هر لوکوس) شناسایی شدند. تجزیه کلاستر بطور جداگانه برای ارقام و پایه ها بر اساس حضور و عدم حضور باند با استفاده از برنامه NTSYS و ضریب تشابه Dice مبتنی بر UPGMA انجام گرفت. دندوگرام حاصل از ارقام نشان داد که ارقام مورد بررسی تنوع زیادی داشتند و در 6 کلاستر جای گرفتند و سیبهای گلاب مورد بررسی توسط این 5 جفت نشانگر از هم تفکیک شدند. در دندوگرام پایه ها شباهت دو پایه MM111و MM106 مشاهده گردید.با استفاده از 3 آغازگر (CH01H01,02B1,CH02B10) باندهای اختصاصی در ارقام (24 رقم) مشاهده شد. همچنین اگوی نواربندی اختصاصی برای بعضی از ارقام در هر آغازگر بدست آمد. در نهایت این 5 آغازگر توانستند آللهای اختصاصی مربوط به پایه ها را تعیین کنند. کلمات کلیدی: مارکر SSR شناسایی مولکولی ارقام و پایه های سیب مقدمه مهمترین درختان میوه ای که در مناطق معتدله و سردسیری به صورت اهلی درآمده‌اند در خانواده گلسرخیان قرار دارند مانند سیب، گلابی، آلوچه، گیلاس و..... . سیب از نظر اقتصادی بیشترین اهمیت را در بین محصولات درختی مناطق معتدله و سردسیری دارد و تعداد زیادی از ارقام تجاری آن به دلیل گرده‌افشانی باز، تلاقی‌های كنترل شده و یا تلقیح موتاسیون سوماتیكی با ارقام سازگار، قابل استفاده در برنامه‌های اصلاحی اند. یك مشكل قابل توجه در صنعت سیب و فراورده های آن تعیین هویت ارقام آن می‌باشد. روشهای سنتی تعیین هویت بر اساس مشاهده ظاهری درخت ومیوه است. با توجه به اینكه بسیاری از خصوصیات ظاهری تحت تأثیر عوامل محیطی قرار می گیرند، این روش، قابل اعتماد نیست. روش دیگر برای تعیین هویت ارقام استفاده از نشانگر می باشد. استفاده از نشانگرها در سطح مولكول DNA دقیق ترین روش بررسی است که جزئیات بیشتری از ژنوم ارقام سیب را ارائه می‌دهد. ازجمله نشانگرهای معتبردر بررسی ژنوم سیب، نشانگر SSRاست که به دلیل قابلیت تکرارپذیری بالا، ایجاد الگوی باندی نسبتاً ساده و توارث هم بارز، در بررسی تنوع ژنتیکی و شناسه دار کردن ارقام سیب کارایی بالایی دارد. در این تحقیق با استفاده از نشانگرهای منتخب SSR تنوع ژنتیکی 29 رقم و پایه سیب و امکان دستیابی به نوارهای اختصاصی DNA در هر یک از ارقام و پایه ها مورد بررسی قرار گرفت. فهرست مطالب چکیده: 1 مقدمه 2 فصل اول:بررسی منابع و کلیات 3 1-1- تاریخچه و گسترش سیب در جهان 4 2-1- درخت سیب و خواص بتانیكی آن 5 3-1- فرآورده‌های سیب 6 4-1- خواص دارویی سیب 6 5-1- ارزش غذایی سیب 7 6-1- پایه‌های سیب 8 1-6-1-پایه‌های بذری 8 2-6-1- پایه‌های رویشی(غیر بذری) 9 1-2-6-1-پایه‌های مالینگ 9 2-2-6-1- پایه های مالینگ مرتون 10 3-2-6-1-پایه های بوداگوسکی 11 7-1- زیست شناسی مولكولی 11 1-7-1- نشانگر 11 2-7-1- هدف از كاربرد نشانگر 11 3-7-1- انواع نشانگرهای ژنتیكی 12 1-3-7-1- نشانگرهای ریخت‌شناسی (مورفولوژیكی) 12 2-3-7-1- نشانگرهای سیتوژنتیكی 12 3-3-7-1- نشانگرهای ملکولی در سطح پروتئین 12 4-3-7-1- نشانگرهای مولكولی در سطح DNA 13 5-3-7-1- انواع نشانگرهای DNA 14 الف) نشانگرهای DNA غیر مبتنی بر PCR - تفاوت طول قطعات حاصل از هضم (RFLP) 14 - تعداد متفاوت ردیف‌های تكراری و ماهوارك‌ها (VNTR & Minisatellites) 15 - پویش ژنومی نشانه‌های هضم (RLGS) 15 ب) نشانگرهای DNA مبتنی بر PCR 15 4-7-1- ردیف‌های تكراری 17 1-4-7-1- ماهواره‌ها 18 2-4-7-1- ماهوارك‌ها 18 3-4-7-1- ریز ماهواره‌ها (میكروستلایت‌ها یا SSR) 19 5-7-1- چگونگی ایجاد میكروستلایت‌ها 20 6-7-1- خصوصیات نشانگرهای SSR 20 7-7-1- كاربردهای نشانگرهای SSR 21 8-7-1- مزایای ریز ماهواره ها 21 9-7-1- معایب ریز ماهواره‌ها 22 10-7-1- اساس چند شكلی در جایگاههای ریزماهواره 23 1-10-7-1- مدل کراسینگ اور نا متقارن (UCO) 23 2-10-7-1- مدل سر خوردن پلیمراز هنگام همانند سازی(SSM) 24 8-1- واكنش زنجیره ای پلیمراز 24 1-8-1- اجزای واکنش PCR 24 1-1-8-1- آنزیم 24 2-1-8-1-مخلوط ذروكسی نوكلئوتید تری فسفات ( dNTPs ) 25 3-1-8-1- DNA الگو 25 4-1-8-1- آغازگرها 25 5-1-8-1- بافرها و كلرید منیزیوم 26 2-8-1- عوامل مؤثر براختصاصی بودن واكنش PCR 26 1-2-8-1- غلظت مخلوط PCR 26 2-2-8-1- دما 27 3-2-8-1- تعداد و طول سیكل 27 4-2-8-1- افزاینده های PCR 27 3-8-1- (TD-PCR) Touch Down PCR 27 4-8-1- PCR آشیانه ای 28 9-1- الكتروفورز ژل آگارز 28 10-1- الكترفورز ژل پلی آكریل آمید 29 11-1- مروری بر تحقیقات انجام شده توسط نشانگر SSR 29 فصل دوم مواد و روشها 31 1-2- مواد گیاهی 32 2-2- استخراج DNA 36 1-2-2- استخراجDNA به روش دلاپورتا 36 2-2-2- استخراج DNA به روش CTAB 37 3-2- تعیین کیفیت نمونه های DNA 38 4-2- تعیین کمیت نمونه های DNA 39 5-2- PCR 39 1-5-2- اجزای واکنش زنجیره‌ای پلیمراز 39 1-1-5-2- آغازگرها 39 2-1-5-2- آنزیم Taq DNA polymerase 40 3-1-5-2- بافر PCR 41 4-1-5-2- کلرید منیزیوم 41 5-1-5-2- dNTP 41 2-5-2- بهینه سازی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز 42 6-2- الكتروفورز فراورده های PCR 43 1-6-2- الكتروفورز افقی در ژل آگارز 43 2-6-2- الكتروفورز عمودی در ژل پلی آکریل آمید 43 1-2-6-2- تیمار شیشه‌ها 44 2-2-6-2- تزریق ژل 44 3-2-6-2- گرم نمودن ژل 45 4-2-6-2- واسرشته سازی محصولات PCR 45 3-6-2 رنگ آمیزی ژل 46 7-2- تجزیه و تحلیل داده ها 47 1-7-2- امتیازدهی باندها 47 2-7-2- تجزیه خوشه ای 48 3-7-2-تعیین اندازه باندها و الگوی نواربندی اختصاصی 48 فصل سوم نتیجه گیری و بحث 49 1-3- نتایج استخراج DNA 50 2-3- بهینه سازی دمای اتصال آغازگرها 52 3-3- بهینه سازی روش PCR 52 4-3- بررسی نهایی نتایج حاصل از PCR 52 5-3- بررسی چند شکلی های SSR 54 6-3- بررسی و تحلیل روابط خویشاوندی بین ارقام 57 7-3- تعیین شناسنامه ژنتیکی برای ارقام 60 7-3- تعیین شناسنامه ژنتیکی برای ارقام 61 1-7-3- تعیین آللهای اختصاصی 61 2-7-3- الگوی نواربندی اختصاصی در ارقام 61 8-3- بررسی میزان خویشاوندی بین پایه ها 64 9-3- تعیین شناسنامه ژنتیکی برای پایه ها 65 1-9-3- تعیین آللهای اختصاصی 65 فصل چهارم:نتیجه گیری کلی و پیشنهادات 75 نتیجه گیری کلی 80 پیشنهادات 84 ضمائم 87 منابع و مآخذ: 90
